原代細胞分離實驗:體外將動物某組織,經酶法或機械處理法分離成單細胞,并在合適的培養基中篩選出特定細胞,使得目的細胞得以生存、生長和繁殖。
1、無菌:確保使用無菌設備、試劑和技術收集和處理組織。使用個人防護設備以避免污染。使用0.22微米的膜無菌過濾所有酶和試劑。
2、切塊:用無菌剪刀或手術刀將組織標本切成小塊(通:常為2x4mm),然后將小塊放入選定的緩沖液、培養基或鹽溶液中。
3、加酶:將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白,然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常,約0.5 mg/ml~ 1.5mg/ml的酶。
4、孵育:將組織樣本在其佳溫度下孵育,通常在37°C下孵育30~ 90分鐘。定期混合或輕輕搖動標本。
5、洗滌:通過輕輕移液來分散細胞(也稱為研磨),然后,使用細網過濾細胞懸浮液。讓細胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次。含有FBS, BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。
6、分析:將細胞重懸于正確的培養基或緩沖液中,然后定量測定細胞產量和活力。這是細胞分離過程中的重要步驟,因此您可以評估解離技術的結果。大多數研究人員使用血細胞計數器測定細胞產量,并使用臺盼藍重氮染料測量細胞活力。
7、培養:這個適合,就可以根據所分離的細胞來選擇適臺研究的方案和處理步驟來培養細胞了。