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免疫熒光實驗離不開以下技巧！
發(fā)布時間： 2022-03-29 點擊次數： 1336次免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光實驗是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。免疫熒光實驗的技巧：1、細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2、固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5min.3、通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5min.4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.5、一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.6、二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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