免疫共沉淀實驗
當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。當用預先固化在argarose beads上的蛋白質A的抗體免疫沉淀A蛋白,那么與A蛋白在體內結合的蛋白質B也能一起沉淀下來。再通過蛋白變性分離,對B蛋白進行檢測,進而證明兩者間的相互作用。
免疫共沉淀實驗(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是一種經典的生物化學技術,用于研究蛋白質之間的相互作用。其原理主要基于抗體和抗原之間的專一性結合作用。以下是對免疫共沉淀原理的詳細解釋:
一、基本原理
?抗體與抗原的專一性結合?:免疫共沉淀利用抗體能夠特異性地識別并結合其對應抗原的特性。這種專一性結合是免疫共沉淀技術的基礎。
?細胞裂解?:首先,細胞需要在非變性條件下被裂解,以保留細胞內蛋白質之間的相互作用。這樣,原本在細胞內相互結合的蛋白質在裂解后仍然保持結合狀態。
?抗體與靶蛋白的結合?:將特異性的抗體加入到細胞裂解液中,抗體將與裂解液中的靶蛋白(即已知或待研究的蛋白質)形成抗原-抗體復合物。
?復合物沉淀?:如果系統中存在與靶蛋白相互作用的蛋白質(稱為結合蛋白),這些結合蛋白也會與靶蛋白-抗體復合物結合,形成更大的蛋白質復合物。隨后,通過離心或其他物理方法,可以將這些復合物沉淀下來。
二、實驗步驟(簡要)
?細胞裂解?:在非變性條件下裂解細胞,獲取細胞裂解液。
?抗體結合?:在細胞裂解液中加入特異性的抗體,使抗體與靶蛋白結合形成復合物。
?沉淀復合物?:通過離心或其他方法將蛋白質復合物沉淀下來。
?洗脫與分析?:對沉淀物進行洗脫,去除非特異性結合的雜質,然后進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)及Western blotting等分析,以確定與靶蛋白相互作用的蛋白質。